Estudio in vitro de liberación de proteínas de AFCo1 y sus implicaciones en la inmunización mucosal / In vitro study of protein release from AFCo1 and implications in mucosal immunisation

El cocleato adyuvante Finlay (AFCo1) 1 es derivado de un proteopolisoma de Neisseria meningitidis serogrupo B. La transformación de los proteoliposomas en AFCo1 potencia la respuesta inmune de los antígenos de Neisseria cuando se administra por vía intranasal o intragástrica. Se ha demostrado, sin embargo, que la vía intranasal es más efectiva. Los objetivos de este trabajo fueron evaluar in vitro la liberación de proteínas del AFCo1 en líquido nasal o gástrico simulado, usando para ello la prueba de microdisolución y apoyar los resultados obtenidos cuando se administró AFCo1 por vía intranasal o intragástrica en ratones BALB/c. Los resultados demostraron que la dilución de AFCo1 en líquido gástrico o nasal simulado afecta la distribución de los antígenos de proteína de Neisseria , ya que estos se liberaron de las estructuras de cocleatos más rápido cuando se utilizó líquido nasal. Se concluyó que las condiciones que simulan el entorno gástrico afectan la distribución de los antígenos de proteínas de AFCo1 y este resultado puede explicar parcialmente porqué la administración intranasal es más efectiva in vivo que la inmunización intragástrica(AU)

Adjuvant Finlay Cochleate 1 (AFCo1) is a Proteoliposome-derived cochleate obtained from Neisseria meningitidisserogroup B. Transformation of proteoliposomes into AFCo1 potentiates the immune response on Neisseriaantigens when it is administered by intranasal or intragastric (i.g) routes. However, the i.n route has beendemonstrated to be more effective. The aim of this work is to evaluate in vitro the protein release from AFCo1, insimulated gastric fluid (SGF) or simulated nasal fluid (SNF) using a microdissolution test and to provide support for the results found when AFCo1 was administered by i.g or i.n routes in BALB/c mice. Results showed that dilution of AFCo1 in simulated gastric fluid affects the delivery of Neisseria protein antigens because they were released from cochleate structures faster than when simulated nasal fluid was used. In conclusion, conditions simulating gastric environment affect the delivery of protein antigens from AFCo1 and this result could partially explain whyin administration is more effective in vivo than in immunisation(AU)

Evaluación de la irritabilidad en mucosa del adyuvante AFCO1 por el método de HET-CAM / Evaluation of the mucosal irritation of AFCo1 adjuvant by HET-CAM method

Los adyuvantes pueden producir irritación local en la mucosa y esto pudiera ser una limitación para su uso clínico. Para evaluar si el adyuvante vacunal AFCo1, un cocleato obtenido a partir del proteoliposoma de Neisseria meningitidis, produce irritación directa en la mucosa nasal, se estudió el efecto de su aplicación en la membrana corioalantoidea del embrión de pollo (MCA), por la técnica de HET-CAM (hen's egg test on chorioallantoic membrane), según el Protocolo 47 de INVITTOX, método alternativo que sustituye la clásica prueba de Draize en conejos. En este ensayo se utilizaron por cada producto a evaluar (AFCo1 o amortiguador fosfato salino como diluente) tres huevos de gallinas White Leghorn de 10 días de embrionados; para los controles positivos de irritación (NaOH a 0,1 N y SDS al 1 por ciento) se utilizaron dos huevos para cada uno. Los productos fueron aplicados en la MCA para evaluar las lesiones de lisis, hemorragia y coagulación, a los 5 min. Las sustancias se clasificaron según una escala establecida para productos no transparentes. Adicionalmente se realizó una evaluación microscópica de las MCA tratadas para confirmar las observaciones realizadas. Al determinar el grado de severidad de las tres reacciones, después de la aplicación de AFCo1 y del diluente, ambos clasifican como no irritantes, lo que evidencia que este cocleato no produce lesión epitelial directa. Este resultado, además, confirma la utilidad del HET-CAM para la determinación de irritabilidad nasal de adyuvantes vacunales(AU)

Adjuvants can cause local irritation of the mucosa and this might be a limitation for their clinical use. In order to evaluate if AFCo1, a novel intranasal adjuvant based on a proteoliposome-derived cochleate structure from Neisseria meningitidis B, produces mucosal irritation, the direct effect after its application on the chorioallantoic membrane (CAM) of hen's eggs was studied using HET-CAM (hen's egg test on chorioallantoic membrane), according to protocol 47 of INVITTOX, an in vitro validated method that substitutes the classic Draize´s test in rabbits. Three 10-days-old eggs were used for each evaluated product (AFCo1 or PBS as vehicle) and two eggs for each positive control of irritation (NaOH a 0.1 N y SDS at 1 percent). The products were applied on the CAM to evaluate the grade of lyses, haemorrhage and coagulation, at five minutes. The products were classified according to an established scale for non transparent substances. Additionally, a microscopic evaluation was carried out to confirm previous results. When determining the severity degree of the three reactions after the application of AFCO1 and the diluent, they show to be non irritant, what demonstrates that this cochleate does not produce direct epithelial damage. Our results also reveal the utility of HET-CAM as tool for the evaluation of mucosal irritation of vaccine adjuvants(AU)

Evaluación citotóxica y genotóxica del adyuvante AFCo1 por el ensayo de morfología de la cabeza del espermatozoide en ratón NMRI / Cytotoxic and genotoxic evaluation of the adjuvant AFCo1 by the sperm head morphology assay in NMRI mice

Se realizó un estudio para evaluar el potencial citogenotóxico en células espermàticas de ratón, del adyuvante AFCo1 (Adyuvante Finlay Cocleato 1) obtenido a partir del proteoliposoma de Neisseria meningitidis serogrupo B. El AFCo1 y su diluente se administraron por vía intranasal en una dosis de 40 µL (1 mg/mL), mientras que los controles positivo (ciclofosfamida) y negativo (agua destilada estéril), se administraron por vía oral a razón de 40 mg y 1 mL/kg respectivamente. Se utilizaron ratones (NMRI) de 8-12 semanas de edad, con peso corporal entre 27-30 g, a los cuales se les aplicaron cinco dosis con un intervalo de 24 h durante los primeros cinco días del experimento. Se evaluó la toxicidad general (peso corporal) e indicadores testiculares de citotoxicidad testicular (concentración espermàtica) y genotoxicidad (morfología espermàtica). El AFCo1 y su diluente no provocaron toxicidad general, citotoxicidad, ni genotoxicidad. La ciclofosfamida sí produjo citotoxicidad (47,77 por ciento) y genotoxicidad (534,61 por ciento). Se concluye que el AFCo1 y su diluente pueden ser considerados como no tóxicos para las células espermàticas en el nivel de dosis y para el biomodelo animal utilizado(AU)

This study was developed to evaluate the cytogenotoxic potential on mice spermatic cells of the candidate adjuvant, AFCol (Adjuvant Finlay Cochleate 1 Adjuvant); obtained from the proteoliposome of Neisseria meningitidis serogroup B. The AFCo1 and its diluent were administered via intranasal in a 40 µL dose (1 mg/mL), while the positive control (ciclofosfamide) and the negative one (sterile distilled water) were administered orally in 40 mg and 1 mL/kg respectively. Rats (NMRI) were from 8 to 12 week of age with weighing from 27 to 30 g and they were administered 5 doses with an interval of 24 hours during the first 5 days of the experiment. General toxicity (body weight), cytotoxicity of testicles (spermatic concentration) and genotoxicity (spermatic morphology) were evaluated. AFCol and its diluent provided neither general toxicity, cytotoxicity, nor genotoxicity. The cyclophosphamide produced cytotoxicity (47.77 percent) and genotoxicity (534.61 percent). It is concluded that AFCol and its diluent, could be considered non toxic for the spermatic cells with the dose level and the animal biomodel used(AU)